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聚合酶链反应在阴道毛滴虫检测中的条件优化和引物筛选

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中国疾病预防控制中心性病麻风病防治技术指导中心
徐敏 尹跃平 余艳华 刘爱英 王书崎

    阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)可引起滴虫性阴道炎和尿道炎等多种男女性生殖泌尿器官疾病,全世界每年阴道毛滴虫感染的发病人数约为1.8亿。资料表明,阴道毛滴虫感染是促进人类免疫缺陷病毒(HIV)和其它非溃疡性STD病原体感染的因素之一。近年来,许多学者将PCR应用于阴道毛滴虫病的检测,并认为该方法诊断滴虫感染敏感而特异。自1992年Riley等首次报道了用于滴虫病诊断的引物以来,有多种新引物被应用,共计10余种。但尚无资料对各种引物进行过系统地比较。为此,我们从文献中筛选了3对引物,先对各自的PCR条件进行优化,然后比较了它们的敏感性并用临床标本进行了初步验证。
    1.方法:
    参考1992年~2002年国内外文献报道的10种引物,选出被应用频率、敏感性和特异性相对较高的3对引物TVA5-TVA6、TV1-TV2、TVK3-TVK7进行PCR条件优化和敏感性比较。
    根据Taguchi法,上述4因素3个浓度水平进行排列组合,形成一个正交表。(表1)每种PCR有9个反应条件。

表1 L9(34)正交表

实验号
引物
Mg 2+
dNTPs
Taq酶
1
A
A
A
A
2
A
B
B
B
3
A
C
C
C
4
B
A
B
C
5
B
B
C
A
6
B
C
A
B
7
C
A
C
B
8
C
B
A
C
9
C
C
B
A

    3种PCR扩增条件则参照有关文献在PERKLN ELMER 9600 仪器上进行。每种条件下的反应产物均取8μL上样,于1.5%的琼脂糖凝胶稳压电泳,紫外灯下观察结果。采用凝胶成像处理系统分析凝胶图像,扫描测定每种反应条件下的产物面积,以此代表该条件下的PCR相对产物量。
    2. 数据处理 每种PCR表5在9种反应条件下重复3次,获得的产物面积取平均值, 以此代表该条件下的PCR相对产物量。每种反应条件下的产物量可以用来评价该条件的扩增效果,根据Taguchi法,通过计算信噪比(SNL)实现。
    SNL=-10log(1/n∑ni=11/yi2)
    公式中, n为水平数目,本实验中n =3, y为产物量。将每种反应条件下的产物量带入上公式中,计算此条件下的信噪比。然后根据以下方程得到曲线, 进而得到最大信噪比,得出每个因素的最佳水平。
    s=ax2+bx+c ,其中s为已计算出的信噪比、x为选定的因素的水平值。
    将每种PCR得出的最佳条件与各自9种实验条件(表4)下的扩增产物量进行比较,观察是否有非特异性条带出现及是否获得较高产物量。
    3. 结果:
    (1)特异性、
    3种PCR检测沙眼衣原体等病原体及正常人阴道分泌物标本,结果均为阴性。在3种PCR优化后,依照最佳条件再进行检测,结果仍为阴性。说明三种引物对于检测阴道毛滴虫均有良好的特异性。
    (2)PCR的图像分析及相对产量
    对于每种PCR分别在9种反应条件下重复3次,扩增产物琼脂糖凝胶稳压电泳,获得的产物面积取平均值, 以此代表该条件下的PCR相对产物量(表2)。

表2 PCR相对产物量

实验号
PCR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
TVA5-TVA6 PCR 194 481 594 356 508 435 463 437 445
TV1-TV2 PCR 395 935 999 1107 1038 860 1122 876 1400
TVK3-TVK7 PCR 1312 1739 2391 2404 2189 2515 2532 2905 2919

    根据表2中的相对产量,依据公式计算信噪比(SNL),根据方程s=ax2+bx+c得到曲线, 在实际的反应条件下(x>0),得到最大信噪比, 进而得出每个因素的最佳水平。
    (3)敏感性
    TVA5-TVA6 PCR能够检测到的最小量为1:10000的DNA提取物5μL, TV1-TV2 PCR能够检测到的最小量为1:100000的DNA提取物5μL, TVK3-TVK7 PCR能够检测到的最小量为1:100000的DNA提取物2μL,故TVK3-TVK7 PCR的敏感性最高。

    4.讨论
    PCR技术的问世,使实验室检测感染性病原体的敏感性和特异性明显提高。但影响PCR结果的因素较多,所以尽管有推荐的常规PCR反应方案,但这些推荐的条件对于不同的DNA序列和引物有必要进行优化。
    本实验选择PCR反应体系中的引物、Mg 2+ 、dNTPs 、Taq酶4因素进行优化,研究表明,引物、Mg 2+ 、dNTPs 、Taq酶4因素均会影响PCR产物量,总体而言,如果任一种反应物用量过低都会使PCR产物量降低,反之,则会产生非特异性扩增带。其中, Mg 2+ 的浓度变化对实验结果的影响最为明显。
    本实验属多因素联合优化,每种PCR共有81(34)种反应条件,而使用Taguchi 方法进行反应因素和反应水平的排列组合, 每种PCR只有9种反应条件。Taguchi 方法是质量工程优化的主要技术, 该方法除在工业领域已经得到世界范围的广泛应用外,在医学研究领域,也被用于PCR条件的优化,方法简便而效率高,尽管也需要进行较多的计算才能得到最终结果,但我们认为Taguchi 方法仍不失为值得推广的摸索PCR反应条件的一种方法。

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