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基因芯片技术检测生殖器溃疡性疾病病原体

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中国医学科学院 (中国协和医科大学) 皮肤病研究所
刘爱英 尹跃平 孙建方 陈祥生 余艳华 张津平 徐敏 王书崎

    基因芯片技术是近年来发展的新型技术,芯片检测的程序主要包括4个部分:芯片方阵的构建,样品的制备及标记,生物分子反应和信号的检测及分析。目前基因芯片检测技术在感染性疾病诊断中的应用还处于起步阶段。本研究自行设计了用于引起生殖器溃疡性病原体检测的基因芯片。
    1. 芯片方阵的构建
    (1)探针的设计:探针的设计使用软件包Primer premier 5.0,并注意使各探针的杂交动力学性质相近。各病原体特异探针序列及相关参数见表1

表1

探针
长度
核苷酸序列
探针位置
参考杂交温度
梅毒螺旋体 37bp 5'-NH2-(T)8 TAACGCTTGGGTCAGTCTCGTACTCCCAC 360-333 72.5℃
杜克雷嗜血杆菌 36bp 5'-NH2-(T)8 CCCCTCCATAAG CCAGATTCCCAAGCAT 119-146 74.6℃
单纯疱疹病毒I型 36bp 5'-NH2- (T)8 ACTCGAGTTTGA TGGGGGGCAGAAACAG 2749-2776 70.8℃
单纯疱疹病毒II型 33bp 5'-NH2- (T)8 TCGAGCTTGATCGGGGGGAGGAACA 2765-2789 75.3℃
沙眼衣原体 34bp 5'-NH2- (T)8 GTTCAGCAGGATTCCCC ACAGGCAGA 59-33 73.2℃

    (2)点样:将合成的探针用点样液稀释至10μmol/L,Cartesian Pixsys 7500点样仪在醛基修饰的基片上点成一定的矩阵,设立阳性对照和阴性对照。
    4. 各病原体和临床标本靶基因的荧光标记: PCR反应程序:95℃ 5 min ;95℃ 20s,60℃ 20s,72℃ 20s;35个循环;72℃ 10min。分别进行了1种、2种、3种、4种及5种模板多重标记PCR。
    5. 杂交反应: 取6μL荧光标记PCR反应液,加1μL阳性对照液及经50℃预热的杂交液7μL,混匀后95℃变性5 min,后全部转移到芯片的点样区域,加盖玻片(注意不要有气泡);放入带有湿度的杂交盒,密封杂交盒,然后放入50℃杂交仓内,保温1h ,注意避光。然后打开杂交盒,取出芯片,用0.2%SDS冲掉盖玻片,然后把芯片放入有0.2%SDS的染色缸,放置5 min,用ddH2O冲洗两次。室温避光干燥。
    6. 扫描与结果判断:杂交完成后,用GMS418 Array Scanner 扫描仪进行芯片扫描,根据点样图谱进行结果分析判断。阳性结果均可得到荧光信号图像,阴性结果均不能得到荧光信号图像。
    结 果
    1.基因芯片检测特异性:用5种试验菌株及其它11种生殖道常见的相关病原体测试基因芯片的特异性,结果5种试验菌株均可得到特异的荧光信号,相互之间无交叉反应;11种生殖道常见的相关病原的基因组DNA及正常人的基因组DNA均未获得阳性信号。
    2.基因芯片检测灵敏性:分别将各病原体DNA做梯度稀释,使之含量从1.2ng/μL到0.0012ng/μL,同时用水作阴性对照,荧光标记后进行芯片杂交检测,结果终点检出浓度为0.0012ng。
    讨 论
    基因芯片技术是融微电子学、生物学、物理学、化学和计算机科学为一体的高度交叉的新技术,具有重大的研究价值。由于该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上,所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析,从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低检测量等不足,可以在一张芯片同时对多个患者进行多种疾病的检测。国外Nanogen公司和BD公司合作开发感染性疾病诊断基因芯片,已经取得重要成果。
    本试验中,分别和同时对5种试验菌株及其它皮肤和生殖道常见的病原体进行了杂交检测,结果均没有交叉反应;连续梯度稀释最终检出病原体DNA的浓度为0.0012ng/ul。
    初步证明,利用基因芯片技术同时进行多种病原菌的检测是完全可行的,具有比较理想的特异性、准确性和敏感性。

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